固定组织RNA提取试剂盒

固定组织RNA提取试剂盒
RNApureFFPEKit
Cat No：DY6169


产品组分
		组分 Contents	50T
		Buffer 1 #	15ml
		Buffer 2 #	1.25ml
		Buffer 3 #	45ml
		Buffer 4#（concentrate）	11ml
		Buffer 5 #	10ml
		过滤柱	50个
		吸附柱	50个
		收集管	50个
		离心管	50个


储运条件
	本试剂盒中Buffer 2 #保存在-20℃，其余组分保存在室温（15-25℃）干燥条件下保存。保质期一年
说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。
产品简介
	本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总 RNA。适合从小于 30mg 的石蜡包埋组织或切片中抽提高纯度的总 RNA，本试剂盒无需使用酚/氯仿抽提和异丙醇沉淀，一小时内即可完成多个样品的抽提。本试剂盒使用专门优化的裂解液，释放福尔马林固定或组织切片样本中的RNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效释放组织切片中的 RNA，而避免危害 RNA 的完整性；优化的缓冲系统使裂解液中的 RNA 可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；可通过漂洗步骤有效去除，经过洗脱的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Real-timeRT-PCR 和印迹分析等实验。
实验前准备及注意事项
	1. 本实验需要无水乙醇、10mMPBS（PH7.4）等请自备。
	2. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，用水彻底冲洗后高压灭菌。
	3. 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
	4. 获得样品后，尽快将样品在4–10%的福尔马林中固定，固定时间以14–24小时为宜，时间过长易导致RNA断裂，影响下游实验。

	5. 第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer 4 #中加入无水乙醇。
	6. 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制Buffer 2 #的作用。 Buffer 2 #勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
	7. 使用前请检查Buffer1#和Buffer3#是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer1#和Buffer3#于56℃水浴重新溶解。
	8. 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤
	1. 样品处理 1）石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。
	2）福尔马林等固定液中的样本：取约20mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl10mMPBS（PH7.4）,涡旋震荡，10,000rpm（～11,200×g）离心1min，重复3次，可直接进行第7步操作。
	2. 将组织块切成5–10µm的薄片。注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
	3. 取约1×1cm2的切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10s。
	4. 12,000rpm（～13,400×g）离心2min，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
	5. 加入1ml 无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000rpm离心2min，弃上清，注意不要吸弃沉淀。注意：乙醇可以除去样品中残余的二甲苯。
	6．打开管盖，室温或最高至37°C孵育10min，直至无乙醇残留
	7．加入150 μlBuffer1#，重悬沉淀；加入10 μlBuffer 2 #，涡旋震荡混匀。
	8． 56℃孵育15min，直至样品完全溶解。80℃孵育15min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。注意：1）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。 2）56℃孵育完后的样品可以放在室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80 ℃之后再把样品置于80℃孵育。
	9．加入320 μlBuffer3#，涡旋震荡彻底混匀。
	10．将步骤9所得溶液全部加入到过滤柱中(过滤柱应预先放入收集管中)， 10,000rpm离心1min，收集滤液。
	11．在步骤10得到的滤液中，加入720 μl 无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。

	12. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rmp离心1min,倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新装入收集管中。注意：吸附柱的最大载量为100 µg不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
	13. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 4#（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
	14. 重复步骤13。
	15．12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
	16. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4 #，室温放置1min，12,000 rpm离心1min，收集RNA溶液， -70℃保存RNA，防止降解。注意：1）Buffer 4 #体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4 #重复步骤16 3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸到吸附柱中，重复步骤16。

	12. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rmp离心1min,倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新装入收集管中。注意：吸附柱的最大载量为100 µg不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
	13. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 4#（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
	14. 重复步骤13。
	15．12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
	16. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4 #，室温放置1min，12,000 rpm离心1min，收集RNA溶液， -70℃保存RNA，防止降解。注意：1）Buffer 4 #体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4 #重复步骤16 3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸到吸附柱中，重复步骤16。

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