血液RNA提取试剂盒(DNase I) | ||||||||
RNApure Blood Kit(DNase I) | ||||||||
(离心柱式) | ||||||||
Cat No: DY6172A | ||||||||
Kit Size:50T | ||||||||
产品组分 | ||||||||
组分 Contents | 50preps | |||||||
DNase I | 1000 U | |||||||
10×Reaction Buffer | 1000 μl | |||||||
Buffer 1 #(10X) | 60ml | |||||||
Buffer 2 # | 35ml | |||||||
Buffer 3 # | 40ml | |||||||
Buffer 4 #(concentrate) | 11ml | |||||||
Buffer 5 # | 10ml | |||||||
过滤柱 | 50 | |||||||
吸附柱 | 50 | |||||||
1.5ml离心管 | 50 | |||||||
2ml收集管 | 100 | |||||||
储运条件 | ||||||||
DNase I、10×Reaction Buffer保存在-20℃,加入β-巯基乙醇的2#裂解液可以保存一月,其他试剂常温保存。 | ||||||||
说 明 | 本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途。 | |||||||
产品简介 | ||||||||
本试剂盒适用于从新鲜全血(用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的血液样品)中提取总RNA,可以处理多至1.5ml的全血,洗脱可以得到大于200bp的高纯度RNA,多个样品可以在1h内完成。本产品无需CsCI纯化的超离心步骤和LiCI或乙醇沉淀,不含有苯酚或氯仿等有毒溶剂,经过纯化的RNA有效去除血红素、肝素等酶抑制剂和污染物,可直接用于各种分子生物学常规实验,如RT-PCR、Norhern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。 | ||||||||
实验前准备及注意 | ||||||||
1. 样品应避免反复冻融,否则影响提取RNA提取率和质量。样品在Buffer 2 #中,可于-70℃保存一个月。 | ||||||||
2. 使用前请检查Buffer 2 #是否出现结晶或者沉淀,可置于56℃水浴冲洗溶解。Buffer 2 #在使用前请加入β-巯基乙醇,至终浓度1%。如1ml Buffer 2 # 加β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer 2 #室温下可于保存1个月。 |
3. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer 4 #中加入无水乙醇。 | ||||||||
4. 本试剂盒不能用于加入抗凝剂的冷冻血液样品RNA提取。 | ||||||||
5. Buffer 1 #(10X)需要在使用前将溶液用于RNase的水进行10倍稀释,稀释后置于2-8℃ 保存。 | ||||||||
6. 自备的试剂:β-巯基乙醇、70%乙醇(用于RNase的水配制)、无水乙醇。 | ||||||||
预防RNase污染,应注意事项 | ||||||||
1. 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。 | ||||||||
2. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h,塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min,用水彻底冲洗后高压灭菌。 | ||||||||
3. 配制溶液应使用无RNase的水。 | ||||||||
4. 操作人员戴一次性口罩和手套,并且要经常换手套。 | ||||||||
操作步骤 | ||||||||
1. 向0.5-1.5ml新鲜的抗凝全血样本中,加入5倍体积的1X Buffer 1 # (请于使用前用无RNase的水将10 X Buffer 1 # 稀释10倍),轻轻涡旋或颠倒混匀。冰上孵育10-15min,孵育过程中混匀两次。 | ||||||||
注意:孵育过程中浑浊的悬液变成透明,证明红细胞被裂解,必要时可以把孵育时间延长至20min. | ||||||||
2. 4℃ 2100 rpm(400xg)离心10min,小心吸弃上清液。 | ||||||||
3. 向以上沉淀中加入2倍血液样品体积的1x Buffer 1 #(请于使用前用无RNase的水将10x Buffer 1 #稀释10倍),轻轻涡旋,充分重悬沉淀。 | ||||||||
4. 4℃ 2100 rpm(400xg)离心10min,小心吸弃上清液。 | ||||||||
注意:此步一定要完全去除上清液否则影响裂解导致RNA产量下降 | ||||||||
5. 向沉淀中加入Buffer 2 #(使用前检查是否加入β-巯基乙醇),0.5-1.5ml血液样品加入600μl Buffer 2 #,或小于0.5ml血液样本加入350μl Buffer 2 #,混匀。 | ||||||||
6. 将所得液体转移到过滤柱(过滤柱应预先装入收集管中)中,12000rpm(-13400 x g)离心2min,收集滤液,弃掉过滤柱。 | ||||||||
7. 向所得滤液加入1倍体积(600μl或350μl)的70%乙醇(无RNase水配制),混匀。 | ||||||||
注意:加入乙醇后可能产生沉淀,不会影响后续实验。 | ||||||||
8. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12000rmp离心15s,倒掉收集管中的溶液,将吸附柱重新装入收集管中。 | ||||||||
9. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 3#,10,000 rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。 |
10. 配制DNase I 混合液:取52 μl Buffer 5 #,向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I(1 U/μl),混匀, 配制成终体积为80 μl的反应液。 | ||||||||
11. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液,20-30℃孵育15min。 | ||||||||
12. 向吸附柱中加入350μl Buffer 3 #,12000rpm离心15s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
13.向吸附柱中加入500μl 4#(使用前检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心15s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新收回收集管中。 | ||||||||
14.重复步骤13。 | ||||||||
15. 12000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干。 | ||||||||
注意:此步的目的是将吸附柱中残留的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR)。 | ||||||||
16. 将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管(1.5ml)中,向吸附柱的中间部位加入30-50μl Buffer 5# ,室温放置1min,12000rpm离心1min,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。 | ||||||||
注意:1)Buffer 5#液体的体积不应小于30μl,体积过小影响回收率。 | ||||||||
2)如果要提高RNA的产量,可用30-50μl新的5#溶液重复步骤16。 | ||||||||
3)如果要提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤16。 | ||||||||