酵母 RNA 提取试剂盒(含DNase I)

酵母 RNA 提取试剂盒(含DNase I)
RNApure Yeast Kit ( DNase I )
离心柱式
Cat No:LY6176A
Kit Size:50T


产品组分
		组分 Contents	50preps
		DNase I	1000 U
		10×Reaction Buffer	1000 μl
		Buffer 1#	35ml
		Buffer 2#	40ml
		Buffer(concentrate) 3#	11ml
		Buffer 4#	10ml
		Buffer 5#	300 μl
		Buffer 6#	30ml
		离心管	50
		吸附柱	50
		收集管	50


储运条件
	本试剂盒中Buffer 5#、DNase I、10×Reaction Buffer 需在-20℃保存，其他组分室温15℃-25℃干燥条件保存。
说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。
产品简介
	本试剂盒用于常见的各种真菌的总 RNA 的快速提取。既可以提取液体培养物，也可以直接提取固体培养基上的真菌菌落。操作简单快捷，单个样本 30min即可完成提取全过程，所提 RNA 纯度高，OD260/280一般都在 2.0 左右。提取的 RNA适用于 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot 、cDNA 合成等实验。
实验前准备及注意事项
	1. 需要自备试剂：：β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）、70%乙醇（用无RNase的水配制）
	2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
	3. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，用水彻底冲洗后高压灭菌。
	4. 配制溶液应使用无RNase的水。

	5. 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
	6. 样品应避免反复冻融，否则会影响RNA提取的的量和质量。对于有些细胞壁较厚以及在培养阶段会产生大量代谢物的酵母，最好在生长的早期就收集样品。
	7. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer3# 中加入无水乙醇。
	8. 使用前请检查Buffer 1#是否出现结晶或者沉淀，可置于56℃水浴重新溶解。Buffer 1#在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为1%。如1 ml Buffer1#加10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer1#室温可保存1个月。
	9. Buffer 6#在使用之前应加入β-巯基乙醇，1 ml的Buffer 6#加入10 μl的β-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇的Lyticase Working Buffer可以在室温下储存1个月。
	10. 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，所有操作步骤动作要迅速。
操作步骤
	1. 取约1-5 ml 酵母培养物，12,000 rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸取全部上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
	注意：酵母培养物最多不超过3×107个细胞，一般对于酿酒酵母OD600值为1.0时，相当于1-2×107细胞/ml。
	2. 酵母细胞壁的去除：向菌体中加入600 μl Buffer 6#（使用前检查是否加入β-巯基乙醇，使其终浓度为1%）,并加入5 μl Buffer 5#（10 U/μl），充分混匀，并在摇床上220 rpm/min，30℃处理30min。4,000 rpm（~1,500×g）离心10min，弃上清，收集沉淀。
	注意：以上为3×107个酵母细胞Lyticase用量，根据酵母的菌株和酵母细胞数量的不同，所用的Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。
	3. 向沉淀中加入350 μl Buffer 1#（使用前加入终浓度为1%的β-巯基乙醇）反复吹打几次，使其充分裂解。如果有可见不溶物，最大转速离心2min，取上清进行下一步。
	注意：尽量使细胞充分悬浮并充分裂解否则影响RNA产量。
	4. 向步骤3所得到的溶液中加入1倍体积（350 μl）的70%乙醇（Buffer 4#配制），混匀。
	5. 将步骤 4 所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm 离心 15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	6. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 2#，10,000 rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	7. 配制 DNase I 混合液：取 52 μl Buffer 4#，向其中加入 8 μl 10 × Reation Buffer 和 20 μl DNase I（1 U/μl），混匀，配制成终体积为 80 μl 的反应液。

	8. 向吸附柱中直接加入80 μl DNase I 混合液，20-30℃孵育 15min。
	9. 向吸附柱中加入 350 μl Buffer 2#, 12,000 rpm 离心 15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	10. 向吸附柱中加入 500 μl Buffer 3#（使用前检查是否加入无水乙醇）,12,000 rpm 离心 15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	11. 重复步骤 10。
	12. 12,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
	注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。
	13. 将吸附柱置于一个新的无 RNase 离心管，向吸附柱的中间部位悬空加入 30-50 μl Buffer 4#，室温放置 1 min，12,000 rpm 离心 1 min，收集 RNA 溶液，-70℃保存。
	注意：1）Buffer 4# 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。
	2）如果要提高 RNA 的产量，可用 30-50 μl 新的 Buffer 4# 重复步骤 13。
	3）如果要提高 RNA 浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。

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