细菌细胞总RNA 提取试剂盒 （DNase I）参考价： ￥1160
价格： ￥1044
货品编号： DY6179A
规格：
50T
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| 细菌细胞总RNA 提取试剂盒 （DNase I） | ||||||||
| RNApure Bacteria Kit（DNase I） | ||||||||
| 离心柱式 | ||||||||
| Cat No:DY6179A | ||||||||
| Kit Size:50T | ||||||||
| 产品组分 | ||||||||
| 组分 Contents | 50preps | |||||||
| DNase I | 1000 U | |||||||
| 10×Reaction Buffer | 1000 μl | |||||||
| Buffer 1# | 35ml | |||||||
| Buffer 2# | 40ml | |||||||
| Buffer(concentrate) 3# | 11ml | |||||||
| Buffer 4# | 10ml | |||||||
| 过滤柱 | 50 | |||||||
| 离心管 | 50 | |||||||
| 吸附柱 | 50 | |||||||
| 收集管 | 100 | |||||||
| 储运条件 | ||||||||
| 本试剂盒室温15℃-25℃条件下运输，室温15℃-25℃的干燥条件保存。 | ||||||||
| 说 明 | ||||||||
| 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
| 产品简介 | ||||||||
| 本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从细菌或培养的动物细胞中快速提取总 RNA，30-40 min即可完成反应。提取的总 RNA 纯度高，没有蛋白质和其他污染，如果是对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase I 在柱上进行消化去除。提取的 RNA 适用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、体外翻译等实验。 | ||||||||
| 实验前准备及注意事项 | ||||||||
| 1. 本实验需要无水乙醇、Lysozyme（LY5018）、TE缓冲液、β-巯基乙醇，请自备。 | ||||||||
| 2. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10min，用水彻底冲洗后高压灭菌。 | ||||||||
| 3. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 | ||||||||
| 4．配制溶液应使用无RNase的水。 | ||||||||
| 5. 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套 | ||||||||
| 6. 提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取的量和质量 | ||||||||
| 7. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer 3# 中加入无水乙醇。 | ||||||||
| 8. 使用前请检查 Buffer 1# 是否出现结晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer 1# 在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为 1%。如 1 ml Buffer 1# 加 10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer 1# 室温可保存 1 个月。 | ||||||||
| 9.所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。 | ||||||||
| 操作步骤 | ||||||||
| 1. 4℃ 10,000 rpm（~13,400×g）离心2min收集菌体（菌体量最大不超过1×109），小心去除所有上清。 | ||||||||
| 注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。 | ||||||||
| 2. 用含有Lysozyme的100 μl TE缓冲液彻底重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下： | ||||||||
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TE 缓冲液中 Lysozyme 的终浓度 孵育时间 | |||||||
| G-细菌 400 μg/ml 3-5 min | ||||||||
| G+细菌 3 mg/ml 5-10 min | ||||||||
| 3. 加入350 μl Buffer 1#（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀）。将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管的过滤柱中，10,000 rpm离心2min，收集滤液，弃掉过滤柱。 | ||||||||
| 4. 向上步得到的滤液中加入250 μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入到吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中，10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 2#，10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
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6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl
10 × Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。 注意: 以上体系为按照我公司产品DNase I （Cat No：LY6060）反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。 |
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| 7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15min。 | ||||||||
| 8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer 2#, 10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 3#（使用前检查是否加入无水乙醇）, 10,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 10. 重复步骤6。 | ||||||||
| 11. 12,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 | ||||||||
| 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。 | ||||||||
| 12. 将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4#室温放置1min，10,000 rpm离心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。 | ||||||||
| 注意：1） Buffer 4# 体积不应小于 30 μl，体积过小影响回收率。 | ||||||||
| 2） 如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4#重复步骤12。 | ||||||||
| 3） 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。 | ||||||||