细菌基因组提取试剂盒参考价： ￥390
价格： ￥351
货品编号： DY6007
规格：
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| 细菌基因组DNA提取试剂盒 | ||||||||
| BacteriaGen DNA Kit | ||||||||
| 离心柱式 | ||||||||
| Cat No:DY6007 | ||||||||
| Kit Size:50T | ||||||||
| 产品组分 | ||||||||
| 组分 Contents | 50preps | |||||||
| Buffer 1# | 15ml | |||||||
| Buffer 2# | 15ml | |||||||
| Buffer 3#(concentrate) | 13ml | |||||||
| Buffer 4#(concentrate) | 15ml | |||||||
| Buffer 5# | 15ml | |||||||
| Buffer 6# | 1ml | |||||||
| 离心管 | 50 | |||||||
| 吸附柱 | 50 | |||||||
| 收集管(2ml) | 50 | |||||||
| 储运条件 | ||||||||
| 本试剂盒中Buffer 6#保存在-20℃，可保存12个月。其它组分室温（15-25℃）条件下可保存12个月，更长时间保存可置于2-8℃。 | ||||||||
| 说 明 | ||||||||
| 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
| 产品简介 | ||||||||
| 本试剂盒适用于从革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌中提取高纯度总DNA，也适用于真菌等样本。本试剂盒每次可处理106-108个细胞，获得多至20 μg的总DNA。纯化过程中不需苯酚或氯仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀，一小时内即可获得高纯度DNA。 | ||||||||
| 本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，而其他污染物可流过膜，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。 | ||||||||
| 实验前准备及注意事项 | ||||||||
| 1. 本实验需要无水乙醇， 请自备。提取革兰氏阳性菌需自备：Tris、Na2-EDTA、TritonX-100、Lysozyme。 | ||||||||
| 2. Buffer 6#勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。 | ||||||||
| 3. 全部离心步骤可在室温下进行。 | ||||||||
| 4. 使用前请检查 Buffer 1#和Buffer 2# 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将 Buffer 1#和Buffer 2#于 56℃水浴孵育恢复澄清。 | ||||||||
| 5. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer 3#和Buffer 4#中加入无水乙醇。 | ||||||||
| 6．如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。 | ||||||||
| 7. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。 | ||||||||
| 8. 如果提取样品为革兰氏阳性菌，需客户自行配制Enzymatic Lysis Buffer处理菌体，其中需使用浓度为20 mg/ml的Lysozyme（溶菌酶），Lysozyme本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，Cat No:DY5018。 | ||||||||
| 9．如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer 2#前加入4 μl DNase-Free的RNase A（100 mg/ml），RNase A本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，Cat No:LY5012。 | ||||||||
| 操作步骤 | ||||||||
| 革兰氏阴性菌基因组DNA的提取 | ||||||||
| 1．取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，10,000 rpm（~11,500×g）离心1min，尽量吸净上清。 | ||||||||
| 2．向沉淀中加入180 µl Buffer 1#，振荡使菌体重悬。 | ||||||||
| 3．加入20 µl Buffer 6#，涡旋混匀，56℃孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。 | ||||||||
| 注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 µl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液（Cat No:LY5012），震荡混匀，室温放置5-10min。 | ||||||||
| 4．加入200 µl Buffer 2#，涡旋震荡充分混匀。加200 µl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 | ||||||||
| 注意：1）如果多个样品一起操作，Buffer 2#和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入，震荡混匀。 | ||||||||
| 2）加入Buffer 2#和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。 | ||||||||
| 5．将步骤4所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到吸附柱中(吸附柱应预先装入收集管中)，一次最多不超过700 μl，可分多次转入。10,000 rpm 离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。 | ||||||||
| 6．向吸附柱中加入500 µl Buffer 3#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 | ||||||||
| 7．向吸附柱中加入500 µl Buffer 4#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。 | ||||||||
| 8．12,000 rpm（~13,400×g）离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 | ||||||||
| 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。 | ||||||||
| 9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 µl Buffer 5#，室温放置2-5min，10,000 rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 | ||||||||
| 注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。 | ||||||||
| 2）离心之前室温孵育5min可以增加产量。 | ||||||||
| 3）如果要增加产量，可用50-200 µl Buffer 5#或灭菌水再次洗脱。 | ||||||||
| 4）如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200 µl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 µg，推荐用50 µl Buffer 5#或灭菌水洗脱。 | ||||||||
| 5）保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer 5#洗脱并于-20℃保存 | ||||||||
| 革兰氏阳性菌基因组DNA的提取 | ||||||||
| 1．取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，10,000 rpm（~11,500×g）离心1min，尽量吸净上清。 | ||||||||
| 2．加入180 μl Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。 | ||||||||
| Enzymatic Lysis Buffe配方：20 mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；终浓度为20 mg/ml的Lysozyme（溶菌酶）。 | ||||||||
| 3．37℃孵育30min。 | ||||||||
| 4．加入20 μl Buffer 6#涡旋震荡，充分混匀。加入200 μl Buffer 2#，涡旋震荡混匀。 | ||||||||
| 注意：不要把Buffer 6#直接加到Buffer 2#中。 | ||||||||
| 5．56℃孵育30min。 | ||||||||
| 注意：1）如果需要，95°C孵育15min可以使病原体失活，但是95°C孵育会造成一些DNA的降解。 | ||||||||
| 2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液（货号：LY5012），震荡混匀，室温放置5-10min。 | ||||||||
| 6．加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。 | ||||||||
| 注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。 | ||||||||
| 7. 将步骤 6 所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到吸附柱中(吸附柱应预先装入收集管中)，一次最多不超过700 μl，可分多次转入。10,000 rpm 离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。 | ||||||||
| 8．向吸附柱中加入500 μl Buffer3#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 9．向吸附柱中加入500 μl Buffer 4#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤9。 | ||||||||
| 10.12,000 rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟彻底晾干。 | ||||||||
| 注意：这一步目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。 | ||||||||
| 11.将吸附柱置于一个新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50-200 μl Buffer 5#，室温放置2-5min，10,000 rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。 | ||||||||
| 注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。 | ||||||||
| 2）离心之前室温孵育5min可以增加产量。 | ||||||||
| 3）如果要增加产量，可用50-200 µl Buffer 5#或灭菌水再次洗脱。 | ||||||||
| 4）如果要提高DNA的终浓度，可以将所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤11；若洗脱体积小于200 µl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 µg，推荐用50 µl Buffer 5#或灭菌水洗脱。 | ||||||||
| 5）保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer 5#洗脱并于-20℃保存 | ||||||||