酵母质粒小提试剂盒

酵母质粒小提试剂盒
Yeast Plasmid Mini Kit
离心柱式
Cat No:DY6105
Kit Size:50T
产品组分
		组分 Contents			50preps
		Buffer 1#			15ml
		Buffer 2#			15ml
		Buffer 3#			20ml
		Buffer 4#			30ml
		Buffer 5#			30ml
		Buffer (concentrate) 6#			15ml
		Buffer 7#			10ml
		Buffer 8#			300μl
		Buffer 9#			30ml
		Buffer 10#			150μl
		玻璃珠			2g
		吸附柱			50


储运条件
	本试剂盒室温15℃-25℃条件下运输。
	本试剂盒置于室温15℃-25℃的干燥条件下，可以保存12个月。2℃-8℃保存可以保存更长时间，但是容易产生沉淀，使用前应将试剂盒内的所有溶液在室温平衡30min,必要时可在37水浴中预热10min,易溶解沉淀。
	第一次使用前将Buffer 10#加入Buffer 1#中，混匀后置于2℃-8℃，可以稳定保存6月以上。

说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。

产品简介
	本试剂盒在普通碱裂解法的基础上进行了改进，全新的Lyticase可以有效的破除酵母细胞壁，新型硅基质膜和缓冲液系统能高效专一的结合质粒DNA，同时可以最大限度去除蛋白及其他杂质，整个过程方便快捷，不需使用有毒有害试剂，可以同时处理多个样品。除适用于酵母细胞外，也可用于大肠杆菌。使用本试剂盒提取的质粒DNA可用于各种分子生物学实验，如连接、转化、测序和文库筛选等。
参考说明
	样品量		洗脱体积	实验时间	提取方法
	1-5ml箘液		50-2100μl	1.5h-2 h	离心柱式

实验前准备及注意事项
	1.本实验需要β-巯基乙醇,无水乙醇,请自备。
	2.试剂盒所以组分应在室温静置30min以上。
	3.溶液配制;第一次使用前，将Buffer 10#溶液全部加入到Buffer1# 中，混匀，置于2-8℃保存。
	4．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer 6#中加入无水乙醇。

	8.将吸附柱重新放回收集管中，16,200×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温5-10min，以彻底晾干。
	注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。
	9.将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100μl Buffer 6#，室温放置2-5min，16,200×g离心2min，将质粒溶液收集到收集管中。-20℃保存质粒。
	注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5min，16,200×g离心5min。 Buffer 6#在65-70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。
	2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。

	5.使用前请先检查Buffer 2 #和Buffer 3#是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。
	6.注意Buffer 2 #和Buffer 3#含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。
	7.使用Buffer 4#处理过的吸附柱最好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。
	8.提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。
	9．Lyticase Working Buffer使用前加入终浓度为0.1%的β-巯基乙醇。
	10.所有离心步骤均可在室温下进行。
操作步骤
	1．取1-5 ml酵母培养物（<5×107个酵母细胞）），加入离心管（自备）中，>6,200×g离心2-3min收集细菌，尽量吸弃全部上清。
	注意：菌液较多时，可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中
	2．酵母细胞壁的破除：向菌体中加入600 µl的Buffer 9 #（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），并加入5 µl Buffer 8 #（10 U/µl），充分混匀，并在摇床上220 rpm/min，30℃处理1小时。1500×g (~4000 rpm)离心10钟，弃上清，收集沉淀。加入250 μl Buffer 1#（请先检查是否已加入Buffer 10#），重悬沉淀。
	注意：以上Buffer 8 #的用量和处理时间请根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同进行适当调整。
	3．在以上混合物中加入40 mg的玻璃珠，涡旋混匀，16,200×g（~ 13,000 rpm）离心5 min，将上清转移到一个新的离心管中。
	注意：离心后尽量不要搅动玻璃珠沉淀。
	4．向离心管中加入350μl Buffer 3#，立即上下颠倒混匀4-6次，此时应出现白色絮状沉淀，室温放置5min。16,200×g离心10min。
	注意：Buffer 3# 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
	5．将步骤4中所得的上清液转移到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，16,200×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	注意：吸附柱的最大容积为750 μl，所以第4步中所得溶液分2次过柱。
	6．（推荐步骤）向吸附柱中加入500 μl Buffer 4#，16,200×g离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	注意：如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10 等），此步可省略。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步，如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。
	7．向吸附柱中加入750μl Buffer 5#（请先检查是否已加入无水乙醇），16,200×g 离心1min，倒掉收集管中的废液。

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