哺乳动物蛋白抽提试剂盒参考价: ¥235
价格: ¥211
货品编号: DY7012
规格:
25T
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哺乳动物蛋白抽提试剂盒 | ||||||||
Mammalian Protein Extraction Reagent | ||||||||
Cat No:DY7012 | ||||||||
Size:25T/100T | ||||||||
产品组分 | ||||||||
组分 Contents | DY7012 | DY7012A | ||||||
哺乳动物蛋白抽提试剂 | 25ml | 100 ml | ||||||
蛋白酶抑制剂混合物 | 250 μl | 1 ml | ||||||
储运条件 | ||||||||
蛋白酶抑制剂混合物:-20℃保存,其他室温保存。 | ||||||||
说 明 | ||||||||
本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
产品简介 | ||||||||
哺乳动物蛋白抽提试剂能够快速,温和,高效的裂解哺乳动物细胞,有效提取细胞浆和细胞核蛋白。该试剂使用温和配方保证所提取蛋白保持生物学活性并可应用于多种蛋白分析试验,如:报告基因和酶活性测定,免疫检测,蛋白纯化等。提取后蛋白可采用 BCA 法进行蛋白定量分析。哺乳动物蛋白抽提试剂盒中带有蛋白酶抑制剂混合物,可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解。 | ||||||||
实验前准备及注意事项 | ||||||||
1.为防止蛋白降解,所有的操作尽量在冰上进行。 | ||||||||
2. 对于离心获得的细胞,若不确定细胞体积,可根据细胞数量计算抽提试剂使用量。 如5×106个Hela细胞约需加入500 μl 哺乳动物蛋白抽提试剂,以此类推。 | ||||||||
3.使用本产品获得的蛋白裂解液,可用BCA或Bradford法进行蛋白定量。 | ||||||||
4.本产品可有效裂解细胞培养板培养的贴壁细胞(无需刮取)以及离心收集的悬浮细胞,较反复冻融或超声法具有更高提取效率。但对于组织蛋白的抽提,建议使用组织蛋白抽提试剂,可单独向本公司订购,货号:LY7002,LY7017。 | ||||||||
5.表一中所列的是贴壁细胞蛋白提取的最佳使用量,如果需要减少试剂用量从而获得更高的蛋白浓度,建议首先刮取细胞。 | ||||||||
6.若需获得更高浓度的蛋白,应减少哺乳动物蛋白抽提试剂的使用量。 |
操作步骤 | ||||||||
贴壁细胞蛋白抽提 | ||||||||
1.小心倾去贴壁细胞的培养液。 | ||||||||
2.若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质,请先使用预冷的PBS漂洗细胞。 | ||||||||
3. 请在蛋白抽提前取出实验所需蛋白抽提试剂进行预冷, 按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物(例如990 μl抽提试剂中加入10 μl蛋白酶抑制剂混合物),使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。 | ||||||||
注意:在进行蛋白抽提前2-3min内加入蛋白酶抑制剂混合物。 | ||||||||
4.加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂(使用前2-3min内加入蛋白酶抑制剂),试剂使用量请参考下表,在冰上用枪头吹打贴壁细胞,使裂解液与细胞充分接触,轻轻 摇匀。 | ||||||||
贴壁细胞哺乳动物蛋白抽提试剂使用量推荐表 | ||||||||
细胞培养板类型或培养面积 | 裂解液使用量 | |||||||
100 mm * | 500-1,000 µl | |||||||
60 mm | 250-500 µl | |||||||
6 孔培养板 | 200-400 µl /孔 | |||||||
24 孔培养板 | 100-200 µl /孔 | |||||||
96 孔培养板 | 50-100 µ l /孔 | |||||||
* 对于100 mm培养板培养的107个细胞 (50 mg)可裂解获得约3 mg总蛋白(细胞类型不同略有差异)。 | ||||||||
5.将裂解液转移至新的离心管中,冰上放置20min,使细胞充分裂解。 | ||||||||
6. 14,000×g离心10min。转移上清液至新管中,进行下一步分析。 | ||||||||
注:每100 mg细胞约可提取到6 mg的总蛋白(细胞类型不同略有差异)。 | ||||||||
悬浮细胞蛋白提取 | ||||||||
1.悬浮细胞2,500×g,离心5min,弃去上清。 | ||||||||
2. 可选步骤:若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质,请先使用预冷的PBS漂洗细胞。漂洗后的细胞悬浮液2,500×g离心5min,弃去上清。 | ||||||||
3.请在蛋白抽提前取出实验所需蛋白抽提试剂进行预冷, 按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物(例如990 μl抽提试剂中加入10 μl蛋白酶抑制剂混合物),使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。 | ||||||||
注意:在进行蛋白抽提前2-3min内加入蛋白酶抑制剂混合物。 | ||||||||
4. 加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂,每100 mg (~100 µl)细胞至少加入1 ml哺乳动物蛋白抽提试剂。如提取的样本量较大,可首先使用抽提试剂总使用量的1/10重悬细胞沉淀,然后加入剩余抽提试剂。 | ||||||||
5. 吹打均匀后,冰上放置20min,让细胞充分裂解(冰上放置时间应根据细胞类型不同进行调整)。 | ||||||||
6.14,000×g离心10min。转移上清液至新管中,进行下一步分析。 |
常见问题 | ||||||||
问题 | 可能原因 | 解决方法 | ||||||
低提取率 | 低蛋白表达量 | 优化转染系统 | ||||||
试剂使用量不够 |
增加抽提试剂使用量 |
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试剂无法溶解细胞膜 |
增加裂解时间或者加大晃动幅度 |
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无法获得膜蛋白 | 用哺乳动物蛋白抽提试剂提取核/浆蛋白 | 使用真核细胞膜蛋白抽提试剂盒 | ||||||