miRNA提取试剂盒

miRNA提取试剂盒
miRNA Purification Kit
Cat No：DY6170
Kit Size:6T/50T
产品组分
		组分 Contents	6T	50T
		Buffer 1 #	6ml	60ml
		Buffer 2 #（concentrate）	3ml	15ml
		Buffer 3 #（concentrate）	1ml	11ml
		Buffer 4 #	1ml	10ml
		过滤柱	6个	50个
		吸附柱	6个	50个
		收集管	6个	50个
		离心管	12个	50个

储运条件
	本试剂盒中Buffer 1 #保存在2-8℃，其余组化室温（15-25℃）干燥条件下保存。保质期一年
说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。
产品简介
	北京德元国际科技有限公司开发的miRNA提取试剂盒，是专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA，还可以提取siRNA，snRNA等其他小于200 nt的小分子RNA，同时也可用于总RNA的提取。本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合，独特的裂解液在有效抑制RNases的同时，可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中，如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。本品适用样本范围广，制备的RNA纯度高，可直接用于敏感的下游应用，如Northern Blot分析，Real-Time PCR，Microarray Analysis等。
实验前准备及注意事项
	1. 本实验需要无水乙醇、氯仿等请自备。
	2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
	3. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，用水彻底冲洗后高压灭菌。
	4. 配制溶液应使用无RNase的水。
	5. 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
	6. 提取的样品避免反复冻融，否则影响miRNA提取得率和质量。
	7. 第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer 2 #、Buffer 3 #中加入无水乙醇。
	8. 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤
	一、minRNA富集，可直接用于敏感的下游实验
	1. 样品处理：
	1）组织：30-50 mg组织在液氮中充分研磨后加入1 ml Buffer 1 #，或在组织样品中加入1 ml Buffer 1 #后匀浆处理.样品体积不超过Buffer 1 #体积的10%。
	2) 单层培养细胞：吸去培养液，加入适量Buffer 1 #，每10 cm2 加入1 ml Buffer 1 #。
	3) 细胞悬液：不洗涤细胞，离心收集细胞，弃上清液。每5×106细胞加入1mlBuffer 1#。
	4）血浆或血清：取200 μl血浆或血清样本，加入5倍体积Buffer 1#，震荡混匀30s。
	2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。
	3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm（~13,400×g）离心5min，取上清，转入一个新的离心管（自备）中（如样品中含较多蛋白、脂肪、多糖等，可做此步骤）。
	4. 1) 组织、单层培养细胞、细胞悬液：向以上溶液中加入氯仿，每1mlBuffer 1 #加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。
	2）血浆或血清：每200 μl Buffer 1#加入200 μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。
	5.4℃ 12,000 rpm离心15min，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相转移到一个新的离心管（自备）中。
	6. 向步骤5得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入到过滤柱（过滤柱应预先装入收集管中）中若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12,000 rpm离心30s，离心后弃掉过滤柱，保留流出液。
	7.向步骤6得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀。
	8. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rmp离心20s,倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新装入收集管中。
	9．向吸附柱中加入700 μl Buffer 2#（使用前检查是否加入无水乙醇），12,000 rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	10．向吸附柱中加入500 μl Buffer 3#（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	11.重复步骤10。

	12．12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
	13. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl Buffer 4 #，室温放置1min，12,000 rpm离心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-Free Wate体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4 #重复步骤11 3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸到吸附柱中，重复步骤13。
	二、总RNA的提取，提取的总RNA包括miRNA等其他<200 nt的小分子RNA
	1-5步骤同操作一。
	6．向步骤5得到的溶液中加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀。
	7. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rmp离心20s,倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新装入收集管中。
	8. 向吸附柱中加入700 μl Buffer 2#（使用前检查是否加入无水乙醇）， 12,000 rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 3#（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	10.重复步骤9。
	11. 12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
	12. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4 #，室温放置1min，12,000 rpm离心1min，收集RNA溶液， -70℃保存RNA，防止降解。注意：1）Buffer 4 #体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4 #重复步骤11 3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12.

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