动物组织总RNA提取试剂盒（DNase I）

动物组织总RNA提取试剂盒（DNase I）
RNApure Tissue Kit（DNase I）
Cat No：DY6173A
Kit Size:50T


产品组分
		组分 Contents	50T
		DNaseI	1000U
		10×ReactionBuffer	1000 μl
		Buffer 1 #	35ml
		Buffer 2 #	40ml
		Buffer 3 #（concentrate）	11ml
		Buffer 4 #	10ml
		吸附柱	50个
		收集管	50个
		离心管	50个



储运条件
	DNaseI、10×ReactionBuffer保存在-20℃，其余组分室温（15-25℃）干燥条件下保存。保质期一年
说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。
产品简介
	本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总 RNA。提取样本一般最多 30 mg 组织或 1 x 107 细胞。本试剂盒可回收未完全纯化的 RNA、体外转录和酶促反应后得到的 RNA。本试剂盒也可提取纯化分子量大于 200 碱基的高品质 RNA，几乎无DNA 残留。如果要进行对微量 DNA 非常敏感的 RNA 实验，残留的 DNA 可利用无 RNase 的 DNase I 在柱上进行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。
实验前准备及注意事项
	1. 本实验需要无水乙醇、β-巯基乙醇等请自备。
	2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

	3. 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4h，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10min，用水彻底冲洗后高压灭菌。
	4. 配制溶液应使用无RNase的水。
	5. 提取的样品避免反复冻融，否则影响miRNA提取得率和质量。
	6. 第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer 3 #中加入无水乙醇。
	7. 使用前请检查 Buffer 1#是否出现结晶或者沉淀，可置于 56℃加热重新溶液。Buffer 1#在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为 1%。如 1ml Buffer 1# 加 10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的 Buffer 1# 室温可保存 1 个月。
	8. 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤
	1. 样品处理 1）组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer 1#使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350 μl Buffer 1#。样品体积不超过Buffer 1#体积的十分之一。
	2）单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10 cm2 培养面积加入600 μl Buffer1#，小于6 cm2加入350 μl Buffer 1#，反复吹打几次，使其充分裂解。
	3）细胞悬液：12,000 rpm（～13,400×g）离心1min弃上清，得到细胞沉淀。每5×106-1×107细胞加入600 μl Buffer 1#，少于5×106细胞加入350 μl Buffer 1#，反复吹打几次，使其充分裂解。注意：(1）尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA 产量。 (2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。
	2. 样品充分裂解后，室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。
	3. 12000rpm离心2-5min，取上清进行下步操作。
	4. 加入1倍体积（600 μl或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
	5. 将上步所得溶液全部加入到吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rmp离心1min,倒掉收集管中的溶液，将吸附柱重新装入收集管中。注意：吸附柱的最大载量为100 µg不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
	6. 向吸附柱中加入350 μlBuffer2#，10,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	7. 配制DNase I 混合液：取52 μl Buffer 4 #，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀,配制成终体积为80 μl 的DNase I混合液。
	8. 向吸附柱中直接加入80µlDNaseI 混合液，20-30℃孵育15min。

	9. 向吸附柱中加入350 μlBuffer2#，10,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
	10. 向吸附柱中加入500 μl Buffer 3#（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
	11. 重复步骤10。
	12．12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
	13. 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl Buffer 4 #，室温放置1min，12,000 rpm离心1min，收集RNA溶液， -70℃保存RNA，防止降解。注意：1）Buffer 4 #体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的Buffer 4 #重复步骤3 。 3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸到吸附柱中，重复步骤13。

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