石蜡固定组织提取试剂盒

固定组织基因组 DNA 提取试剂盒
FFPE DNA Kit
离心柱式
Cat No:DY6004
Kit Size:50T

产品组分
		组分 Contents	50preps
		Buffer 1#	15ml
		Buffer 2#	15ml
		Buffer 3#(concentrate)	13ml
		Buffer 4#(concentrate)	15ml
		Buffer 5#	15ml
		Buffer 6#	1ml
		吸附柱	50
		收集管(2ml)	50

储运条件
	本试剂盒中Buffer 6#保存在-20℃，可保存12个月。其它组分室温（15-25℃）条件下可保存12个月，更长时间保存可置于2-8℃。

说明
	本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。
产品简介
	本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总 DNA，包括基因组 DNA 和线粒体 DNA。本品使用专门优化的裂解液和蛋白酶 K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的 DNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效提高 DNA 的产量和纯度；优化的缓冲系统使裂解液中的 DNA 可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；PCR 和酶反应的抑制剂以及残留的杂质可通过两步漂洗步骤有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度 DNA。经过纯化的 DNA 可以直接用于 PCR、Real-time PCR、SNP 基因分型、STR 基因分型和药物基因组学研究等。
实验前准备及注意事项
	1. 本实验需要无水乙醇、10mM PBS（PH7.4）（固定液中的组织）请自备。
	2. Buffer 6#勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
	3. 获得样品后，要尽快将样品在 4–10%的福尔马林中固定，固定时间以 14–24 h为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。
	4.使用前请检查 Buffer 1#和Buffer 2# 是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将 Buffer 1#和Buffer 2# 于 56℃水浴孵育恢复澄清。
	5. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer 3#和Buffer 4#中加入无水乙醇。

	6. 确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制 Proteinase K 的作用。Proteinase K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
	7.如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入4 μlDNase-Free的RNaseA（100mg/ml），RNaseA本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，Cat No:DY5012。
操作步骤
	1．样本处理：
	1）对于石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。
	2）对于福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500 μl 10mM PBS（PH7.4）,涡旋振荡，10,000 rpm（～11,200×g）离心1min，重复3次，可直接进行第7步操作。
	2．将组织块切成5–10 µm的薄片。
	注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
	3．取约1×1 cm2的切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1 ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
	4． 12,000 rpm离心2min，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
	5．加入1 ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12,000 rpm离心2min，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
	6．打开管盖，室温或最高至37°C孵育10min，直至无乙醇残留。
	7．加入180 μl Buffer 1#，重悬沉淀；加入20 μl Buffer 6#，涡旋震荡混匀。
	8． 56℃孵育1h，直至样品完全溶解。90℃孵育1h。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
	注意：1）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。
	2）56℃孵育完后的样品可以放在室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃之后再把样品置于90℃孵育。
	3)如果下游实验对 RNA 污染比较敏感，可加入 4 μl DNase-Free 的 RNase A（100 mg/ml），室温孵育 2 min，再进行步骤3。RNase A 本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，Cat No:LY5012。
	9．加入200 μl Buffer 2#，涡旋震荡彻底混匀。加入200 μl 无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
	注意：1）加入Buffer 2#和无水乙醇后要立即充分混匀。
	2）如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer 2#和无水乙醇事先混匀后加样
	10．将步骤 9 所得溶液全部加入吸附柱中(吸附柱应预先装入收集管中)，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000rpm（～11,500×g）离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

	11．向吸附柱中加入500 μlBuffer 3#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
	12. 向吸附柱中加入500 μlBuffer 4#（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
	13. 12,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
	注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
	14. 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100-200 μlBuffer 5#，室温放置2-5min，10,000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
	注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
	2）离心之前室温孵育5min可以增加产量。
	3）如果要增加产量可以加入50-200 μlBuffer5#或灭菌水再次洗脱。
	4）如果要提高DNA的终浓度，可以将所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，室温放置2-5min，12,000 rpm离心1min,收集DNA溶液。
	5）若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μlBuffer 5#或灭菌水洗脱。
	6）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer5#洗脱并于-20℃保存。

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