| 血液基因组非柱式提取试剂盒 (0.1-20 ml) | ||||||||
| FlexGen Blood DNA Kit | ||||||||
| 离心柱式 | ||||||||
| Cat No:DY6002 | ||||||||
| Kit Size:50ml/200ml | ||||||||
| 产品组分 | ||||||||
| 组分 Contents | 50preps | 200preps | ||||||
| Buffer 1# | 125ml | 2x250ml | ||||||
| Buffer 2# | 30ml | 120ml | ||||||
| Buffer 3# | 30ml | 60ml | ||||||
| Buffer 4# | 250 μl | 1ml | ||||||
| 储运条件 | ||||||||
| 本试剂盒中Buffer 4#保存在-20℃，可保存12个月。Buffer 1#保存在4℃。其它组分室温（15-25℃）条件下可保存12个月，更长时间保存可置于2-8℃。 | ||||||||
| 说 明 | ||||||||
| 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
| 产品简介 | ||||||||
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本试剂盒提供了一种快速、灵活的方法，适用于新鲜或冷冻全血（用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的样品）提取总DNA，包括基因组DNA和线粒体DNA。 本试剂盒可以灵活处理0.1-20 ml的全血，采用非离心柱的方法，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，有效去除蛋白、色素、脂类及其它抑制性杂质污染。整个过程在一个管中操作，减少了污染及样本混淆的风险。提取的DNA产量高、质量好，可直接用于PCR、荧光定量PCR、酶切和Southern Blot以及文库构建等实验。 |
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| 实验前准备及注意事项 | ||||||||
| 1. 本实验需要异丙醇、70%乙醇，请自备。 | ||||||||
| 2. 血液样品反复冻融，会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融，以免断裂。如果提取冷冻血液的基因组DNA，建议37℃水浴，迅速解冻后再进行后续操作。 | ||||||||
| 3. 血液样品的储存： | ||||||||
| 1）短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在2-8℃储存最多10天，对于某些实验例 如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2-8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。 | ||||||||
| 2）长期保存：已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存（如果提取的是高分子量的 DNA，推荐使用EDTA作为抗凝剂）。 | ||||||||
| 4. 所有离心操作均在室温下完成。 | ||||||||
| 操作步骤 | ||||||||
| 一、从100–900 µl全血中提取基因组 （以300 µl 血液处理量为例） | ||||||||
| 1．取300 μl全血于2 ml离心管（自备）中，加入300 μl（样本等体积）Buffer 1#，上下颠倒混匀5次，10,000×g离心30s，弃上清。 | ||||||||
| 2．再向离心管中加入450 μl（1.5倍样本体积）Buffer 1#，涡旋震荡，使沉淀完全分散。10,000 g离心30s，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2min。 | ||||||||
| 注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。 | ||||||||
| 3．按照附表配制Buffer 2#与Buffer 4#的混合液（比例100:1）。 | ||||||||
| 注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。 | ||||||||
| 4．加入150μl Buffer 2# 与Buffer 4# 的混合液， 立即涡旋混匀至溶液无团块。 | ||||||||
| 注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer 2#/Buffer 4#混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。 | ||||||||
| 2）通常涡旋震荡3-4次，每次5s，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质 可以再加入30 μl Buffer 2#/Buffer 4#混合液，再次涡旋混匀。 | ||||||||
| 5．65℃孵育10min，其间颠倒混匀数次。 | ||||||||
| 注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。 | ||||||||
| 6．加入150 μl异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。 | ||||||||
| 注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。 | ||||||||
| 7．10,000×g离心5min。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。 | ||||||||
| 注意：少数时候沉淀可能贴壁不牢，注意不要吸弃沉淀。 | ||||||||
| 9．加入300 μl 70%乙醇，涡旋震荡5s，10,000×g离心5min，弃上清。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 10．把离心管倒置于干净的吸水纸上5min，确保沉淀在管中。 | ||||||||
| 注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 11．空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min）。 | ||||||||
| 注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。 | ||||||||
| 12．加入200 μl Buffer 3#，低速涡旋5s，65℃孵育1h溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。 | ||||||||
| 注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的Buffer 3#溶解DNA，建议延长孵育时间 | ||||||||
| 二、从1-5 ml全血中提取基因组（以3 ml血液处理量为例） | ||||||||
| 1．取3 ml全血于15 ml离心管（自备）中，加入3 ml（样本等体积）Buffer 1#，上下颠倒混匀5次，2,500×g离心5min，弃上清。 | ||||||||
| 2．再向离心管中加入4.5 ml（1.5倍样本体积）Buffer1#，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2,500×g离心5min，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2min。 | ||||||||
| 注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流 | ||||||||
| 3. 按照附表配制Buffer 2#与Buffer 4#的混合液（比例100:1）。 | ||||||||
| 注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。 | ||||||||
| 4．加入1.5 ml Buffer 2#与Buffer 4#混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。 | ||||||||
| 注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer 2#与Buffer 4#混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。 | ||||||||
| 2）通常涡旋震荡3-4次，每次5s可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以 再加入300 μl Buffer 2#与Buffer 4#混合液，再次涡旋混匀。 | ||||||||
| 5．65℃孵育10-30min，其间颠倒混匀数次。 | ||||||||
| 注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。 | ||||||||
| 6．加入1.5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。 | ||||||||
| 注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。 | ||||||||
| 7．2,500×g离心5min。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。 | ||||||||
| 注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 9．加入1.5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5s，2,500×g离心5min，弃上清。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 10．把离心管倒置于干净的吸水纸上5min，确保沉淀在管中。 | ||||||||
| 注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 11．空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min）。 | ||||||||
| 注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。 | ||||||||
| 12．加入300 μl Buffer 3#，低速涡旋5s，65℃孵育1h溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。 | ||||||||
| 注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的 Buffer 3#溶解DNA，建议延长孵育时间。 | ||||||||
| 三、从6-20 ml全血中提取基因组（以10 ml血液处理量为例） | ||||||||
| 1．取10 ml全血于50 ml离心管（自备）中，加入10 ml Buffer 1#，上下颠倒混匀5 次，2,500×g离心5min。 | ||||||||
| 2．再向离心管中加入15ml Buffer 1#，涡旋震荡，使沉淀完全分散。2,500×g离心5 min，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2min。 | ||||||||
| 注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 3. 按照附表配制Buffer 2#与Buffer 4#的混合液（比例100:1）。 | ||||||||
| 注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。 | ||||||||
| 4．加入5 ml Buffer 2#与Buffer 4#混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。 | ||||||||
| 注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer 2#与Buffer 4#混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。 | ||||||||
| 2）通常涡旋震荡3-4次，每次5s可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以 再加入1ml Buffer 2#与Buffer 4#混合液，再次涡旋混匀。 | ||||||||
| 5．65℃孵育30min，其间颠倒混匀数次。 | ||||||||
| 注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。 | ||||||||
| 6．加入5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA。 | ||||||||
| 注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要，应该至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。 | ||||||||
| 7．2,500×g离心5min。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。 | ||||||||
| 注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 9．加入5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5s，2,500×g离心5min，弃上清。 | ||||||||
| 注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。 | ||||||||
| 10．把离心管倒置于干净的吸水纸上5min，确保沉淀在管中。 | ||||||||
| 注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。 | ||||||||
| 11．空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5min）。 | ||||||||
| 注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验，但避免过度干燥DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。 | ||||||||
| 12．加入1 ml Buffer 3#，低速涡旋5s，65℃孵育1h溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。 | ||||||||
| 注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的 Buffer 3#溶解DNA，建议延长孵育时间。 | ||||||||
| 附表 | ||||||||
| 不同体积血液所需各种缓冲液用量 | ||||||||
| 血液样品体积 （μl） | 100 | 300 | 1000 | 3000 | 5000 | 10000 | 20000 | |
| Buffer 1#（μl） | 250 | 750 | 2500 | 7500 | 12500 | 25000 | 50000 | |
| Buffer 2#（μl） | 50 | 150 | 500 | 1500 | 2500 | 5000 | 10000 | |
| Buffer 4#（μl） | 0.5 | 1.5 | 5 | 15 | 25 | 50 | 100 | |
| 异丙醇（μl） | 50 | 150 | 500 | 1500 | 2500 | 5000 | 10000 | |
| 70%乙醇（μl） | 50 | 150 | 500 | 1500 | 2500 | 5000 | 10000 | |
| Buffer 3#（μl） | 100 | 200 | 200 | 300 | 500 | 1000 | 1000 | |
| 补加Buffer 2#和Buffer 4#混合液 | 10 | 30 | 100 | 300 | 500 | 1000 | 1000 | |
