特优无内毒素质粒大提试剂盒参考价： ￥450
价格： ￥380
货品编号： DY6107
规格：
5T
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| 特优无内毒素质粒大提试剂盒 | ||||||||
| EnodFree Plasmid Maxi Kit | ||||||||
| 离心柱式 | ||||||||
| Cat No:DY6107 | ||||||||
| Kit Size:10T | ||||||||
| 产品组分 | ||||||||
| 组分 Contents | 5 preps | 10preps | ||||||
| Buffer 1# | 65ml | 125ml | ||||||
| Buffer 2# | 65ml | 125ml | ||||||
| Buffer 3# | 65ml | 125ml | ||||||
| Buffer 4# | 15ml | 30ml | ||||||
| Buffer 5#(concentrate) | 25ml | 2×25ml | ||||||
| Buffer 6# | 15ml | 30ml | ||||||
| Buffer 7# | 1000μl | 2*1ml | ||||||
| 推柄 | 5 | 10 | ||||||
| 过滤器 | 5 | 10 | ||||||
| 吸附柱 | 5 | 10 | ||||||
| 收集管 | 10 | 20 | ||||||
| 储运条件 | ||||||||
| 本试剂盒室温15℃-25℃条件下运输。 | ||||||||
| 本试剂盒置于室温15℃-25℃的干燥条件下，可以保存12个月。2℃-8℃保存可以保存更长时间，但是容易产生沉淀，使用前应将试剂盒内的所有溶液在室温平衡30min,必要时可在37水浴中预热10min,易溶解沉淀。 | ||||||||
| 第一次使用前将Buffer 7#加入Buffer 1#中，混匀后置于2℃-8℃，可以稳定保存12月以上。 | ||||||||
| 说 明 | ||||||||
| 本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
| 产品简介 | ||||||||
| 内毒素是质粒提取过程中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素很敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。 | ||||||||
| 本试剂盒采用先进的硅基质膜吸附技术，高效专一的结合质粒DNA；并且拥有特殊的缓冲液系统，内有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白质等杂质。 | ||||||||
| 本试剂盒所得质粒纯度高、提取量大，适用于细胞转染，DNA测序,PCR,酶切，连接，转化等多种细胞实验。 | ||||||||
| 参考说明 | ||||||||
| 样品量 | 所得率 | 洗脱体积 | 实验时间 | 提取方法 | ||||
| 100-300ml箘液 | 200μg-2.6mg | 1-3ml | 1h-1.5 h | 离心柱式 | ||||
| 实验前准备及注意事项 | ||||||||
| 1. 本实验需要无水乙醇、异丙醇，本试剂盒中没有配置，请自备。 | ||||||||
| 2. 试剂盒所以组分应在室温静置30min以上。 | ||||||||
| 3. 溶液配制;第一次使用前，将Buffer 7#溶液全部加入到Buffer 1# 中，混匀，置于2-8℃保存。 | ||||||||
| 4．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer 5#中加入无水乙醇。 | ||||||||
| 5. 使用前请先检查Buffer 2 #和Buffer 3 #是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。 | ||||||||
| 6. 注意Buffer 2 #和Buffer 3 #含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。 | ||||||||
| 7. 实验前使用Buffer 4 #处理吸附柱，可最大限度的激活硅基质膜，提高质粒得率。 | ||||||||
| 8. 使用Buffer 4 #处理过的吸附柱最好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。 | ||||||||
| 9. 提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。 | ||||||||
| 10. 所有离心步骤均可在室温下进行。 | ||||||||
| 操作步骤 | ||||||||
| 1．取150 ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，建议最多不超过300 ml）过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，12,000×g离心2-3min收集细菌，尽量吸弃全部上清。 | ||||||||
| 注意：质粒拷贝数较低或>10 kb时，可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer 2#、3#及4#的量需加倍。所加试剂的量必须能够充分裂解菌体，菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。 | ||||||||
| 2．向留有菌体沉淀的离心管中加入12 ml Buffer 1#（请先检查是否已加入Buffer 7#），使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。 | ||||||||
| 注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低 | ||||||||
| 3．向离心管中加入12 ml Buffer 2#，温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3-5min。此时溶液应变得清亮粘稠。 | ||||||||
| 注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免造成基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。 | ||||||||
| 4．向离心管中加入12 ml Buffer 3#，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min。12,000×g离心10min，将上清全部倒入除内毒素过滤器中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml离心 管（自备）中。 | ||||||||
| 注意：Buffer 3# 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。 | ||||||||
| 5．向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀。 | ||||||||
| 6．柱平衡：向吸附柱（吸附柱应预先装入收集管中）中加入2 ml Buffer 4#，12,000 ×g离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 | ||||||||
| 7．将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱（已装入收集管）中。 | ||||||||
| 8．6,000-12,000×g离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
| 注意：吸附柱的最大容积为15 ml，所以第7步中所得溶液分4-5次过柱。 | ||||||||
| 9．向吸附柱中加入10 ml Buffer 5#（请先检查是否已加入无水乙醇），6,000-12,000×g 离心2min，倒掉收集管中的废液。 | ||||||||
| 10.重复步骤9。 | ||||||||
| 11.将吸附柱重新放回收集管中，12,000×g离心5min，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 | ||||||||
| 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。 | ||||||||
| 12.将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入1-3 ml Buffer 6#，室温放置2-5min，12,000×g离心5min，将质粒溶液收集到收集管中。-20℃保存质粒。 | ||||||||
| 注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5min，12,000×g离心5min。 Buffer 6#在65-70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。 | ||||||||
| 2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于1 ml，体积过小影响回收效率。 | ||||||||