高纯质粒大提试剂盒参考价: ¥580
价格: ¥522
货品编号: DY6104
规格:
10T
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高纯度质粒大提试剂盒 | ||||||||
PurePlasmid Mixi Kit | ||||||||
离心柱式 | ||||||||
Cat No:DY6115 | ||||||||
Kit Size:50T | ||||||||
产品组分 | ||||||||
组分 Contents | 2preps | 10preps | ||||||
Buffer 1# | 30ml | 125ml | ||||||
Buffer 2# | 30ml | 125ml | ||||||
Buffer 3# | 30ml | 125ml | ||||||
Buffer 4# | 10ml | 50ml | ||||||
Buffer (concentrate) 5# | 10ml | 2*25ml | ||||||
Buffer 6# | 10ml | 30ml | ||||||
Buffer 7# | 500μl | 2*1ml | ||||||
吸附柱 | 2 | 10 | ||||||
收集管 | 4 | 20 | ||||||
储运条件 | ||||||||
本试剂盒室温15℃-25℃条件下运输。 | ||||||||
本试剂盒置于室温15℃-25℃的干燥条件下,可以保存12个月。2℃-8℃保存可以保存更长时间,但是容易产生沉淀,使用前应将试剂盒内的所有溶液在室温平衡30min,必要时可在37水浴中预热10min,易溶解沉淀。 | ||||||||
说 明 | ||||||||
本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途。 | ||||||||
产品简介 | ||||||||
本试剂盒提供一种简单、快捷、高效提取质粒的方法,在碱裂解法裂解细胞的基础上,采用独特的硅基质膜吸附技术和试剂配方,通过离心吸附柱在高盐状态下高效专一的结合溶液中的质粒DNA,经过两步洗涤,一步洗脱,最大限度的去除蛋白质、基因组、RNA和其他杂质。得到的质粒DNA可直接用于细胞转染、PCR、酶切、测序、连接等生物学实验。 | ||||||||
参考说明 | ||||||||
样品量 | 所得率 | 洗脱体积 | 实验时间 | 提取方法 | ||||
100-300ml箘液 | 200μg-1.5mg | 1-3ml | 1h-1.5 h | 离心柱式 | ||||
实验前准备及注意事项 | ||||||||
1.本实验需要无水乙醇,异丙醇,请自备。 | ||||||||
2.试剂盒所以组分应在室温静置30min以上。 | ||||||||
3.溶液配制;第一次使用前,将Buffer 7#溶液全部加入到Buffer1# 中,混匀,置于2-8℃保存。 | ||||||||
4.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer 5#中加入无水乙醇。 |
9.重复步骤8. | ||||||||
10.将吸附柱重新放回收集管中,16,200×g离心5min,倒掉废液,将吸附柱置于室温5-10min,以彻底晾干。 | ||||||||
注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。 | ||||||||
11.将吸附柱置于一个新的收集管中,向吸附膜的中间部位加入1-3ml Buffer 6#,室温放置2-5min,12,000×g离心2min,将质粒溶液收集到收集管中。-20℃保存质粒。 | ||||||||
注意:1)为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,室温放置2-5min,16,200×g离心5min。 Buffer 6#在65-70℃水浴预热,适当延长吸附和洗脱的时间,可以增加提取效率。 | ||||||||
2)洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液,应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于50μl,体积过小影响回收效率。 |
5.使用前请先检查Buffer 2 #、Buffer 3#、Buffer 4#是否出现结晶或沉淀,如有结晶或沉淀现象,可在37℃水浴几分钟,即可恢复澄清。 | ||||||||
6.注意Buffer 2 #和Buffer 3#含有刺激性物质,请戴手套操作,使用后应立即盖紧盖子。 | ||||||||
7.提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。 | ||||||||
8.所有离心步骤均可在室温下进行。 | ||||||||
操作步骤 | ||||||||
1.取150 ml(根据培养菌体的浓度选择合适的量,建议最多不超过300ml)过夜培养的菌液,加入离心管(自备)中,12000×g离心2-3min收集细菌,尽量吸弃全部上清。 | ||||||||
注意:质粒拷贝数较低或>10 kb时,可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同一个离心管中,同时后续所加试剂Buffer 1#、2#及3#的量需加倍。所加试剂的量必须能够充分裂解菌体,菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。 | ||||||||
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml Buffer 1#(请先检查是否已加入Buffer 7#),使用移液器或涡旋振荡器充分混匀,悬浮细菌沉淀。 | ||||||||
注意:如果菌块未彻底混匀,将会影响裂解效果,使提取量和纯度偏低 | ||||||||
3.向离心管中加入12ml Buffer 2#,温和地上下颠倒混匀6-8次,使菌体充分裂解,室温放置3-5min。此时溶液应变得清亮粘稠。 | ||||||||
注意:温和混匀,不要剧烈震荡,以免造成基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮,提示可能菌量过大,裂解不彻底,应减少菌体量。 | ||||||||
4.向离心管中加入12ml Buffer 3#,立即上下颠倒混匀6-8次,此时应出现白色絮状沉淀,室温放置5min。16,200×g离心10min。 | ||||||||
注意:Buffer 3# 加入后应立即混匀,避免产生局部沉淀。 | ||||||||
5.取上清加入到新的离心管中,并向上清中加入11ml异丙醇,盖紧盖子,上下颠倒混匀。 | ||||||||
6.将步骤4中所得的上清液转移到吸附柱(吸附柱应预先装入收集管中)中,6000-12000×g离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
注意:吸附柱的最大容积为15ml,所以第4步中所得溶液分4-5次过柱。 | ||||||||
7.(推荐步骤)向吸附柱中加入4ml Buffer 4#,6000-12000×g离心2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 | ||||||||
注意: 如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α,TOP10 等),此步可省略。如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21, HB101,JM101, ET12567等),这些宿主菌含有大量核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步,如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。 | ||||||||
8.向吸附柱中加入10ml Buffer 5#(请先检查是否已加入无水乙醇),6000-12000×g离心2mi,倒掉收集管中的废液。 |